“奇效堂醒酒露”对小鼠酒精性肝损伤的防护作用机理研究
关键词:肝硬化；酒精性；中医药疗法；
“奇效堂醒酒露”摘要：给小鼠灌胃二锅头白酒复制酒精性肝损伤动物模型，观察“奇效堂醒酒露”对酒精中毒小鼠肝脏脂质过氧化反应、肝线粒体膜流动性及其线粒体膨胀改变的影响。结果表明，“奇效堂醒酒露”通过对抗酒精中毒引起的肝脏脂质过氧化损伤、调整肝线粒体膜流动性、抑制肝线粒体膨胀而起到有效的保肝作用。
大量酒精摄入后可引起机体多系统损害，肝脏是酒精代谢的主要脏器。在研究“奇效堂醒酒露”防治急性酒精中毒的基础上，通过观察“奇效堂醒酒露”对酒精性肝损伤实验动物肝脏脂质过氧化损伤、肝线粒体膜流动性及肝线粒体膨胀的影响，分析其对酒精性肝损伤的防护作用及作用机理。
材料与方法：
材料 动物：昆明种雄性小鼠，体重24～28g(由中国预防医学科学院流行病学研究所动物中心提供，合格证号京动字第01-3057号)。
试剂：脂质过氧化物标准品四乙氧基丙烷，Fluka产品。1，6-二苯酚-1，3，5-己三烯(DPH)，Sigma产品。Triton-X-100为Rohm-mass产品。5-二巯基-双硝基苯甲酸(DTNB)、硫代巴比妥酸(TBA)及其它化学试剂均为分析纯，北京化学试剂厂产品。
仪器：紫外/可见分光光度计(日本)、MPF-4型荧光分光光度计(日本)，MSE-25型高速离心机(英国)，LAUDA-C型循环恒温水浴(德国)。
“奇效堂醒酒露”：由葛根、枳子、紫苏、鲜白芽根等组成,每支30ml，含生药32.50g。
1.2 分组与处理：肝脏脂质过氧化物(LPO)、谷胱甘肽(GSH)的测定：小鼠46只随机分为正常组10只，模型组12只，”奇效堂醒酒露”大、小剂量组各12只，各组小鼠于实验环境中用普通饲料喂养3天。禁食12小时后，大、小剂量组分别给予“奇效堂醒酒露”32.5g/kg体重和16.25g/kg体重，正常组和模型组以等体积的生理盐水灌胃。1小时后，除正常组外，各观察组给予56度二锅头白酒16ml/kg体重，正常组灌胃等体积的10%葡萄糖溶液。给酒6小时后，断头处死小鼠，取出肝脏，在冰浴下制备20%的肝匀浆，测定肝LPO、肝GSH。
肝线粒体膜流动性、线粒体膨胀抑制百分率的测定：小鼠30只随机分为正常组、模型组和治疗组，每组10只。各组动物于实验环境普通饲料喂养3天。实验时于每日上午治疗组小鼠灌胃“奇效堂醒酒露”16.25g/kg体重；正常组和模型组小鼠灌胃等体积的生理盐水。4小时后，给模型组和治疗组小鼠灌胃45度二锅头白酒16ml/kg体重，正常组小鼠灌胃等体积的10%葡萄糖溶液。第3天给酒后5小时处死动物，取出肝脏，低温冷冻保存。
1.3 实验方法：肝脏LPO测定：以硫代巴比妥酸法;［2］肝脏GSH测定：采用5-二巯基-双硝基苯甲酸法［3］肝线粒体膜流动性测定：常规制备小鼠肝线粒体［4］用Lowry法测定线粒体蛋白质含量，标准品为牛血清白蛋白。分别测定各样本荧光偏振度(P)［5］
(荧光分光光度计激发波长362nm，发射波长432nm)，按［6］公式计算微粘度(η)值，该值增加表示膜的流动性降低。 肝线粒体膨胀水平测定：将新鲜鼠肝线粒体加入盛有介质的试管中，各管蛋白含量均为０.5mg/ml，反应总体积为3.0ml。充分混匀，以紫外/可见分光光度计(波长540nm)测定各管浊度。然后，每管加入表面活性剂Triton-X-100-0.1ml，2分钟后在上述同等条件下比色，测得光密度值［5］比较加入表面活性剂前后的差异，观察药物对线粒体膨胀的影响，以抑制百分率表示。
肝脏LPO、GSH变化:表1示，实验动物一次大量饮酒后，肝脏LPO含量明显升高，与正常组比较差异有显著性(P＜0.05)，而预先给予“奇效堂醒酒露”(大、小剂量组)可使肝脏LPO含量下降，与模型组相比差异有显著性(P＜0.05)。说明”奇效堂醒酒露”可抑制酒精引起的肝脏脂质过氧化反应。小鼠灌胃白酒后，肝脏GSH含量明显下降，与正常组相比差异有显著性(P＜0.001)。”奇效堂醒酒露”两个剂量组肝脏GSH含量显著高于模型组，差异有显著性(P＜0.001)。提示“奇效堂醒酒露”可阻止酒精所致的肝脏GSH的耗竭。
表1 各组实验动物肝脏LPO、GSH含量比较2.2 肝线粒体膜流动性、线粒体膨胀水平分析:小鼠连续3天灌胃白酒后，其肝线粒体膜的荧光偏振度及相应的微粘度均有明显提高，与正常组相比差异有显著性(P＜0.05)。“奇效堂醒酒露”治疗组的P及相应的η值比模型组明显降低，差异有显著性(P＜0.05)。表明”奇效堂醒酒露”能够抑制酒精引起的肝线粒体膜流动性升高。
表2 肝线粒体膜P、η及线粒体膨胀抑制百分率比较“奇效堂醒酒露”是由葛根、枳子、紫苏、鲜白芽根等组成的中药复方制剂，此口服液在北京中医药大学第一临床医院已临床应用多年，具有良好的解酒效果。方中葛花解肌发汗解酒毒，此药首出《别录》“消酒”，《滇南本草》记载：“解酒醒脾，酒痢……酒毒伤胃，吐血，呕血。”《本经逢原》云：“葛花，能解酒毒。”《脾胃论》葛花解酲汤、《滇南本草》葛花清热丸均以葛花为主药。枳子甘平无毒，药性平和，具有清热生津利小便之用。《本草纲目》谓其：“止呕逆，解酒毒”。
《本草拾遗》曰：“止渴除烦，去膈上热，润五脏，利大小便。”紫苏清热燥湿解毒，鲜白芽根化湿醒脾、和胃止呕，全方既可利尿解酒毒，又能保护脾胃。以往实验研究也表明其具有良好的解酒作用，本实验又证明了其保肝作用并提示其作用机理。
3.1 “奇效堂醒酒露”能够对抗酒精引起的肝脏脂质过氧化损伤:急性酒精中毒会导致肝损伤，其损伤机制之一是通过激活氧分子产生氧自由基，导致肝细胞膜脂质过氧化反应引起肝细胞损伤［7］LPO是其产物。LPO在酒精性肝病发病机制中占重要地位。动物长期饮用酒精，细胞器的损害程度与LPO的浓度呈平行关系［8］而体内依赖于还原型GSH的抗氧化系统在抵抗酒精所致肝损伤中起着关键的作用［9］本实验结果显示酒精可引起肝脏脂质过氧化反应增强，而预先给予”奇效堂醒酒露”则可显著抑制酒精导致的肝脏LPO含量增加。
表明“奇效堂醒酒露”可对抗酒精所致的肝脏脂质过氧化反应，减轻酒精对肝细胞的损害。肝脏GSH含量变化显示，酒精可导致肝脏脂质过氧化损伤而引起GSH的耗竭，预先给予”奇效堂醒酒露”可阻抑肝脏GSH的下降。可以认为，“奇效堂醒酒露”对酒精性肝损伤有明显保护作用。其作用机理之一是减轻酒精对肝脏的脂质过氧化损伤反应，提高机体的抗氧化能力。从而清除酒精在肝脏产生的自由基而稳定肝细胞膜的结构，也可能通过减少自由基与膜脂质和膜蛋白共价结合而减轻酒精的肝毒性反应。
3.2 “奇效堂醒酒露”能够保护酒精中毒状态下肝线粒体结构与功能的完整性：生物膜在生命活动中具有重要意义。线粒体膜的流动性与膜的各种重要功能如能量转换、物质运送、信息传递等密切相关［10］要揭示膜中发生各种过程的机制，研究膜脂区的流动性及其对膜功能的影响是一个重要方面，而荧光偏振法是简便易行的技术［11］本实验结果显示，酒精中毒可使肝线粒体膜的流动性发生变化，致肝线粒体膜的流动性降低，从而影响线粒体的能量(ATP)代谢和耗氧功能；“奇效堂醒酒露”能够对抗酒精中毒引起的肝线粒体膜流动性的改变，增强肝线粒体脂质双层膜流动性，保护线粒体结构和功能的完整性。线粒体肿胀是常见的病理变化，是由于水分进入线粒体所致，可由多种病理因素如缺氧、中毒等引起。在电子显微镜下观察，酒精性肝损伤时，肝线粒体可发生明显肿胀。本实验用表面活性剂Triton-X-100诱导肝线粒体膨胀，观察各组线粒体肿胀的变化规律。
结果发现，模型组肝线粒体明显肿胀，显示酒精对Triton-X-100诱导的线粒体肿胀有协同作用。“奇效堂醒酒露”可明显抑制酒精中毒所致的线粒体肿胀，其抑制百分率显著高于模型组，也高于正常组。提示”奇效堂醒酒露”不仅能够对抗酒精中毒引起的线粒体肿胀，而且对Triton-X-100诱导的正常肝细胞线粒体肿胀也有一定的抑制作用，从而维持线粒体的正常功能。超氧阴离子是自由基反应的启动者，在过渡元素存在下，迅速转化为羟自由基。羟自由基可直接参与线粒体膜脂层多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的链锁反应，破坏膜脂的结构，其终产物是小分子醛类、氢过氧化物和烷烃气等。上述产物又可诱发线粒体膨胀，改变膜的流动性和ATP酶活性，这些变化都是破坏线粒体结构与功能完整的因素［6］”奇效堂醒酒露”对肝线粒体结构和功能的保护作用与其抗肝脏脂质过氧化反应有密切关系。
本研究结果显示,“奇效堂醒酒露”不仅可以解除醉酒患者的痛苦，而且对酒精性肝损伤具有良好的保护功能，值得进一步深入研究。参考文献王新月，田德禄，孙承琳。“奇效堂醒酒露”防治小鼠急性酒精中毒的实验研究，中国医药学报等。
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